反相液相色譜柱效高、分離能力強、保留機理清楚，是液相色譜分離模式中使用為廣泛的一種，對于生物大分子、蛋白質及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關．反相色語法是以表面非極性載體為固定相，面以比固定相極性強的溶劑為流動相的—種液相色譜分離模式．反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離．在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、異內醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相．普通的反相色譜固定相和孔徑大于300Å的硅膠鍵合烷基固定相應用較為普遍，聚合物基質的反相色譜固定相也有較多應用。
　　反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大，對于非極性化合物通常遵循以下規則：(弱)非鍵合硅膠 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(強)．溶質保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80Å)的表面積約為250m/g，而300Å孔徑載體的比表面積約為60m/g。當其他條件相同時，溶質在300Å孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80Å孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于強親水性樣品洗脫．樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調整，溶劑強度取決于有機溶劑的性質和其在流動相中的濃度．在反相色譜中，采用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低保留值．固定相的不同也可以導致選擇性發生變化，氰基、苯基、C8、C18等柱的選擇性有很大差異，一般應優先考慮C8、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱。